Thèses & HDR

24 thèses soutenues depuis 2015

mardi décembre 15
Xue ZHAO
Diatoms are one of the ecologically most successful eukaryotic phytoplankton in the world. They are abundant in a wide range of habitats, their physiology, plasticity and fast adaptation to different environmental conditions help them dominate modern Oceans. Compared to genetic regulation, epigenetic changes can be flexible and reversible and histone modifications are one of the epigenetic mechanisms which can impact gene expression. Phaeodactylum tricornutum (P. tricornutum) is one of the model diatom species, also the first unicellular organism with a full repertoire of post-translational modifications of histones, which makes it an ideal species to study epigenetic regulation in single celled organisms. In this thesis manuscript, I focus on histone modification mechanisms in P. tricornutum, utilize classical reverse genetic method: knockout of candidate genes to identify the catalytic enzyme which is responsible of the deposition of histone modifications. Polycomb group protein (PcG) complexes are evolutionarily conserved epigenetic regulatory components that act antagonistically with Trithorax (TrxG) complexes to regulate genes which are involved in cell differentiation and development. In the first chapter we investigated the diversity of PcG and TrxG genes in marine unicellular species, report the correlation of these epigenetic modifiers and environmental factor for the first time, also emphasise the unique co-occurrence pattern of histone marks in P. tricornutum. Based on those discoveries, further study with chapter two and three focused on two PcG complexes, PRC2 and PRC1. In total, three core components of PcG protein were identified in PRC1 and PRC2 complex respectively, the second part of thesis explored the unique function of PRC2 and its associated mark H3K27me3 which I report related to morphology in P. tricornutum. Chapter three discussed the crosstalk between H3K27me3 and H2AK119Ubi which is deposited by PRC1. The last chapter describes a novel histone modification detected in P. tricornutum was found conserved among eukaryotes. The last chapter reports the characterization of this novel mark and identification of the histone writer.
vendredi novembre 06
Alexandre DEMEYER
La réparation des dommages de l’ADN durant les thérapies anticancéreuses peuvent contribuer à la résistance des cellules tumorales, limitant ainsi l’efficacité du traitement. Chez l’homme, la réparation des cassures double-brin (CDB) de l’ADN par recombinaison homologue (RH) fait intervenir la protéine Rad51. Cette protéine s’est révélée être impliquée dans les problèmes de résistance aux traitements anticancéreux puisque son inhibition par différentes approches a pour effet de sensibiliser les cellules cancéreuses aux traitements. Rad51 constitue donc une cible intéressante. Dans ce contexte la recherche d’inhibiteurs de Rad51 permet de proposer des solutions thérapeutiques afin d’améliorer les traitements anticancéreux actuels. Nous avons montré que des petites molécules étaient capables de moduler spécifiquement l’activité de Rad51 _in vitro_ et nos résultats cellulaires ont montré un effet chimiosensibilisateur.
vendredi septembre 11
Maruthi PRASANNA
This study is of great importance for the advancement in the development of pneumococcal vaccines and the improvement of their efficacy. Indeed, researchers have succeeded in preparing and characterizing chitosan nanoparticles loaded with antigen, suitable for immunization. The currently available pneumococcal vaccines are not effective in complete prevention of pneumococcal infections. To develop a better vaccine, first, “we were able to produce a glycoconjugate antigen (molecule resulting from the binding of carbohydrates to proteins or carbohydrates to lipids) based on a common pneumococcal vaccine. On the basis of the positive immune responses generated by the glycoconjugate antigen in mice, we further envisaged that their combination with the nanotechnologies would generate a vaccine with enhanced potential,” explains Maruthi Prasanna. Following this approach, chitosan nanoparticles were used to encapsulate the glycoconjugate. Finally, the developed nanovaccines generated an enhanced immune response against both the protein and polysaccharide components when compared to the naked glycoconjugate.
vendredi juin 12
Surbhi DHINGRA
La modélisation des structures protéiques en l'absence d'homologie est appelée modélisation sans matrice, modélisation libre ou modélisation ab initio. À ce jour, ce type de modélisation reste le plus grand défi du domaine. Durant cette thèse, nous avons apporté une contribution méthodologique pour relever ce défi en explorant l'utilisation d'un alphabet structurel connu sous le nom de blocs protéiques (BP). Il est maintenant possible de prédire le squelette carbonné d’une protéine sous forme de séquence de BPs de n'importe quelle protéine en utilisant des outils comme PB-kPRED. Notre travail a consisté à trouver une méthode pour passer de la séquence de BPs prédite à la structure 3D. Nous avons donc développé une stratégie qui part d'une requête sous forme de séquences de BP prédites et recherche dans une base de données de structures non homologues des fragments de BPs similaires. Notre stratégie tente ensuite d'assembler des fragments sélectionnés pour générer des modèles 3D. Pour cela, nous avons tenté d'exploiter les propriétés inhérentes de Modeller en la contraignant à utiliser des fragments de BPs et à utiliser des prédictions de structures secondaires et de contact comme contraintes externes supplémentaires. Nous avons validé les résultats de cette stratégie sur un sous-ensemble de petites protéines cibles issues de CASP13 sur la base des scores couramment utilisés (GDT_TS et TM-score) pour les protocoles de modélisation gratuits. Nous avons pu montrer que des modèles de bonne qualité peuvent être générés pour de petites protéines en utilisant une combinaison de fragments à base de PB et de Modeller. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives d’application des blocs protéiques pour solutionner l’épineux problème du repliement des protéines.
mardi mars 03
Typhaine VIOLO
Au cours de cette thèse, nous avons mis en place une technologie d'incorporation d'acides aminés non naturels de manière site-spécifique au sein du laboratoire et l’avons appliqué à deux problématiques. Les vaccins glycoconjugués actuels ne couvrent que 13 des 97 sérotypes de Streptococcus pneumoniae. L'utilisation d'une protéine porteuse immunogène permet d'élargir la couverture sérotypique en couplant l'utilisation d'antigènes polysaccharidiques avec des antigènes protéiques. Cependant, les méthodes de conjugaison actuelles ne permettent pas l'étude de l'association optimale entre ces deux antigènes. Dans une première partie, nous avons généré différents vaccins glycoconjugués homogènes en incorporant la Propargyl-Lysine dans la protéine porteuse du pneumoncoque (mPsaA) afin de maîtriser la position ainsi que le nombre des haptens. Les lectines reconnaissent leur ligand saccharidique avec une très bonne spécificité mais avec une affinité généralement faible. Dans une seconde partie de la thèse, nous nous sommes intéressés à l'incorporation d'acides aminés non naturels permettant de former des liaisons covalentes avec les sucres et ainsi augmenter les forces d’interaction entre des lectines et leurs ligands. Nous avons tenté d'incorporer un premier acide aminé non naturel original sans succès. Mais deux autres ont pu être incorporés, dont l'un d'eux au sein de 2 cibles protéiques, en quantité suffisante pour réaliser des tests d'affinité. Cette thèse a donc permis la mise en place d’un nouvel axe technologique au sein du laboratoire et d’en explorer des applications potentielles.
vendredi octobre 25
Johann HENDRICKX
Un ensemble de méthodes permettant d’étudier in silico des interactions protéine-glucide, primordiales dans de nombreux processus biologiques, sont proposées dans cette étude. En s’appuyant sur des informations fournies par la bio-cristallographie, il est devenu possible d’étudier à grande échelle les modalités d’interaction existantes entre ces deux entités moléculaires. Une étude statistique complète fut donc réalisée afin de déterminer aussi bien les tendances générales que les cas extrêmes observés dans les complexes protéine glucide. Les caractéristiques des interactions protéine glucide sont ainsi décrites, en particulier les liaisons hydrogène (LH) et le rôle des molécules d’eau. Un programme d’identification des LH et de reconstitution de leur(s) réseau(x) hypothétique(s) a été développé. Il comprend entre autres l’ajout putatif des hydrogènes, dans le cas où ils sont absents de la structure, notamment sur les groupes hydroxyles et les molécules d’eau. Une stratégie originale pour positionner de manière putative des molécules d’eau sur les sites de reconnaissance protéiques est également décrite. Cette stratégie a pour prétention de permettre le développement d’un protocole d’amarrage moléculaire protéine-glucide, les glucides et les molécules d’eau partageant sensiblement le même réseau de LH. Suite aux nombreuses anomalies décelées dans la PDB au niveau des glucides, une méthode d’identification et de vérification des structures 3D des glucides est également décrite. Elle a permis de limiter les bruits statistiques de cette étude. Environ 280 monosaccharides sous forme furanique et pyranique ont ainsi été référencés. La flexibilité intrinsèque des glucides a également amené à une étude approfondie de la conformation des glucides observée dans les structures cristallographiques.
lundi décembre 17
Mahesh VELUSAMY
Comprendre comment les mutations impactent l’activité d’une protéine reste un défi dans le domaine des sciences protéiques. Les méthodes biochimiques traditionnellement utilisées pour résoudre ce type de questionnement sont très puissantes mais sont laborieuses à mettre en œuvre. Des approches bioinformatiques ont été développées à cet égard pour surmonter ces contraintes. Dans cette thèse, nous explorons l'utilisation d'approches bioinformatiques pour comprendre le lien entre mutations et changements d'activité. Notre modèle d'étude est une enzyme bactérienne, la sucrose phosphorylase de Bifidobacterium adolescentis (BaSP). Cette glycosyl-hydrolase de la famille 13 (GH13) suscite l’intérêt de l'industrie en raison de sa capacité à synthétiser des disaccharides et des glycoconjugués originaux. Son activité consiste à transférer un glucose d'un donneur, le saccharose, à un accepteur qui peut être un monosaccharide ou un aglycone hydroxylé. La réaction enzymatique se déroule selon un mécanisme dit « double déplacement avec rétention de configuration », ce qui nécessite la formation d'un intermédiaire covalent dit glucosyl-enzyme. Cependant, la possibilité de contrôler la régiosélectivité de ce transfert pour qu'il soit applicable au niveau industriel est un enjeumajeur. Cette thèse vise d’une part, à fournir une explication rationnelle quant aux modifications de la régiosélectivité de BaSP apportées par des mutations et d’autre part à proposer un canevas pour le contrôle de la régiosélectivité de couplage en vue de la synthèse de disaccharides pré-biotiques rares comme le kojibiose et le nigerose. Dans notre approche, nous avons émis l'hypothèse que les orientations préférées de l'accepteur dans le site catalytique après formation du glycosyl-enzyme déterminent la régiosélectivité de l'enzyme. Nous avons utilisé des approches computationnelles pour étudier l'impact des mutations sur la liaison de l'accepteur à l'intermédiaire covalent, le glucosylenzyme. À cette fin, nous avons construit des modèles à l’échelle atomique du glucosyl-enzyme pour un ensemble de variants de la BaSP pour lesquels des données expérimentales étaient disponibles. Pour y parvenir, nous avons paramétré le glucosyl-aspartyle en tant que nouveau résidu et les avons intégré dans des outils de modélisation tels que Modeller et Gromacs. Nous avons évalué la pertinence de ces paramètres et les avons ensuite appliqués à la vérification de notre hypothèse de travail par le biais d’expériences d'ancrage moléculaire. La méthodologie utilisée dans ce travail ouvre la perspective de l'utilisation d'approches bioinformatiques pour l'ingénierie de la régiosélectivité de la sucrose phosphorylase et plus généralement des glycosylhydrolases possédant un mécanisme similaire. À cet égard, un pipeline de modélisation moléculaire et d'amarrage de molécules accepteurs sur des intermédiaires covalents des enzymes de cette famille (ENZO pour Optimisation d’ENZyme) a été développé au cours de cette thèse. Son application à l’ingénierie d’autres variants de BaSP est en cours.
mercredi novembre 21
Anaïs NARETTO
Les agars sont des polysaccharides majeurs issus de la paroi des algues rouges. Ces polysaccharides sont composés par des résidus D- et L-galactose alternativement liés par des liaisons glycosidiques -1,4 et -1,3. Ces galactanes présentent de nombreuses modifications: sulfatations, méthylations, pyruvilation, branchement, etc.. Toutes ces modifications rendent complexe la dégradation de ces polysaccharides pour des bactéries marines hétérotrophes. Zobellia galactanivorans est une flavobactérie marine capable de dégrader de nombreux polysaccharides d’algues dont les agars. L’objectif de cette thèse était d’identifier et de caractériser les outils enzymatiques dont dispose cette bactérie pour dégrader les agars complexes. Les deux sujets d’étude de cette thèse sont une -agarase divergente (ZgAgaC) et des sulfatases actives sur des agars. Pour pouvoir réaliser cette étude portant sur des enzymes spécifiques des agars, nous avons mis au point des cribles d’activités sur une collection d’agars naturels qui a été préparée au cours de cette thèse. Ces cribles ont permis de mettre en évidence le comportement divergent de ZgAgaC sur des agars complexes, par rapport aux autres -agarases et -porphyranases de la famille 16 des glycosides hydrolases (GH16). Ils ont aussi permis d’identifier les agars complexes sur lesquels deux sulfatases différentes sont actives. En conclusion, ce travail de thèse a permis de mettre au point différents outils permettant de mettre en évidence de nouvelles activités enzymatiques et aussi de mieux comprendre le catabolisme des agars chez Z. galactanivorans. -- Agars are red algal polysaccharides. These are composed of D-galactose with L-galactose alterned by glycosidic bond -1,4 and -1,3. These galactans harbor several modifications : sulfatations, methylations, pyruvylations. All these modifications hinder the agar degradation by marine bacteria. Zobellia galactanivorans is a marine flavobacterium able to degrade marine polysaccharides, including agars. The aims of this thesis are to identify and characterize the enzymatic tools of Z. galactanivorans to degrade the complex agar. The two subjects are a divergent -agarase (ZgAgaC) and sulfatases that act on agars. To perform this study on the agar specific enzymes, we have developed activity screens on a complex agar collection of substrates produced during the thesis. These screens have been used to show the divergent behaviour of ZgAgaC on complex agar compared to the other -agarases and -porphyranases of the family 16 (GH16). These screens were further used to identify the substrate of two sulfatases active on agar. To conclude, this work has allowed to develop different tools to identify new enzymatic activities and to have a better view of the agar catabolism of Z. galactanivorans.
vendredi mai 18
Nataliya STOROZHYLOVA
This thesis project covers the design, development and in vivo evaluation of a novel self-assembled injectable biodegradable drug delivery system (DDS), composed of in situ hydrogel combined with nanocapsules for lipophilic anti-inflammatory drugs, aiming prolonged intra-articular (IA) residence time and controlled drug release. The moderate initial viscosity allows good syringeability, while rheological properties of the assembled DDS enable resistance to high deformations, displaying the hydrogel suitable for IA application. In this regard, to validate the new delivery system, dexamethasone was used as a model drug. Besides, a novel and potential lead compound for immunotherapeutic anti-rheumatic drug candidate – galectin-3 antagonist was synthesized, characterized and evaluated in this study. The preliminary in vivo results demonstrated remarkable suppression of acute joint inflammation by galectin-3 inhibitor encapsulated within hydrogel and administrated IA at microgram scale doses compared to non-treated control. Overall, the work presented here portrays the DDS with encapsulated synthetic galectin-3 inhibitor as a capable in situ nanotechnology-based platform for arthropathies treatment, intended to contribute to efficient joints therapies.
lundi octobre 30
Florian LAFONT
Les cellules humaines sont soumises à des stress induisant des cassures double-brin de l’ADN principalement réparées par la voie NHEJ, où la kinase DNA-PKcs joue un rôle central. L’activité de DNA-PKcs, régulée par de nombreuses phosphorylations, est cruciale pour le maintien de l’intégrité génomique. Plus récemment, il a été montré que cette protéine était également modifiée par l’O-GlcNAcylation dans la lignée COS7. Sachant l’équilibre existant entre phosphorylation et O-GlcNAcylation, nous avons étudié le rôle de cette nouvelle MPT dans la régulation de l’activité de DNA- PKcs. Nous avons montré que DNA-PKcs est O-GlcNAcylée dans les cellules HeLa. Puis nous avons montré que la modulation de l’O-GlcNAcylation de DNA-PKcs impacte son autophosphorylation en Ser2056, suggérant l’existence d’une balance O-GlcNAcylation /phosphorylation, ainsi que la capacité des cellules à réparer les DSBs par la voie NHEJ. De plus, nos résultats nous laissent envisager que cette modification puisse jouer un rôle dans la stabilité de la protéine. DNA-PKcs est une cible potentielle dans les stratégies de lutte contre le cancer. Nous avons étudié l’impact d’un composé sur DNA-PKcs. Cette molécule provoque une réduction de la quantité et de l’activité de DNA-PKcs, impliquant son ubiquitinylation et sa dégradation par le protéasome et menant à une sensibilisation des cellules à un traitement génotoxique. Dans ce contexte, nous avons développé une puce à anticorps pour évaluer le profil phosphoprotéique des voies de réparation de l’ADN et ainsi évaluer l’effet d’inhibiteurs de DNA-PKcs. L’ensemble de ces résultats contribuent à une meilleure compréhension de la régulation de DNA-PKcs.
lundi octobre 30
Iyanar VETRIVEL
Structural motifs found in protein structures. They help in approximating protein structure as a 1D string with minimal loss of structural information. Here I have employed a widely used structural alphabet called Protein Blocks (PB) for various applications like predicting, comparing and analyzing protein structures. PBs were used to study the structural variations in proteins with identical primary structure and also during the course of molecular dynamics (MD) simulations. The results from these analyses were summarized in the form of substitution matrices and showed striking similarities to previously established matrices for homologous proteins and NMR ensembles. I improved kPRED, a knowledge-based prediction of protein backbone in terms of PBs, by taking into consideration the neighboring local structures. The new version of the algorithm also privileges structural information from homologous proteins when available reaching an average accuracy of 66.3% on a benchmark dataset. The scope of the PENTAdb database has been expanded to cover the entire protein structure space in an automated manner. I show that the effect of this 950% increase in the contents of PENTAdb improves our understanding of the sequence-structure relationship at the pentapeptide level. I also used PB-ALIGN, a fast and efficient protein structure comparison tool, to compare all protein structures in PDB in an all-vs-all manner and to investigate PB-based structural similarities. This generated a huge collection of alignment data and I discuss its use for functional annotation and identification of possible evolutionary relationships.
lundi octobre 02
Titouan JAUNET-LAHARY
La protéine RAD51 est l’un des acteurs majeurs des mécanismes de la résistance et de la reconstruction des cellules cancéreuses. La modulation de son activité ouvre une nouvelle voie dans la lutte contre le cancer. De nouveaux inhibiteurs potentiels de RAD51 ont été recensés, notamment, les dérives du stilbène disulfonique (SD). Dans cette thèse, nous étudions ces inhibiteurs dans différents milieux (solvant et protéine). La première partie de cette thèse est dédiée à l’étude des propriétés physico-chimiques en solution des dérivés SD. À l’aide de spectres optiques expérimentaux et de simulations par calculs quantiques (DFT et TD-DFT), nous avons montré que les SD se présentent sous leur forme dianionique en condition physiologique et la prise en compte du couplage vibronique est cruciale pour simuler des bandes des spectres d’absorption. La seconde partie se focalise sur la modélisation du complexe SD2- en interaction avec la protéine de transport albumine sérique humaine (ASH), qui joue un rôle prépondérant dans le transport de molécule au sein du corps humain. Elle apparaît être un excellent candidat pour acheminer des inhibiteurs SD2- vers les cellules cancéreuses. Sans donnée cristallographique du complexe ASH-SD2-, la modélisation moléculaire est le seul outil prédictif utilisable pour obtenir des données structurales, et nous avons associé ici des méthodes de docking moléculaire et de dynamique moléculaire. Cette méthodologie nous a permis (i) d’identifier le(s) résidu(s) important(s), (ii) d'évaluer les énergies d'interaction par des calculs MM-GBSA et (iii) d'identifier les sites d’accueil les plus adéquats pour les composés de type SD2-.
mardi mai 16
Benoît DAVID
Catalyseurs de la dégradation de polysaccharides dans le cadre de diverses applications industrielles, de nombreuses glycoside hydrolases (GH) possèdent également une activité de transglycosylation qui peut être exploitée pour la synthèse d'oligosaccharides. Afin d'augmenter cette activité, minoritaire par rapport à l'hydrolyse, des expériences de mutagenèse rationnelle peuvent être employées. Toutefois, l'ensemble des bases moléculaires régissant l’équilibre entre ces deux activités reste en revanche difficile a élucider. L'étude de quatre GH (Ttβgly, AgaD, TcTS, TrSA) par simulation de dynamique moléculaire a permis la découverte de canaux d'eau internes à leurs structures et connectant le site actif au milieu. Cette observation suggère que les canaux d'eau internes aux GH pourraient être impliqués dans leur activité d'hydrolyse. Plusieurs paires de résidus bordant deux de ces canaux ont été mis en évidence chez Ttβgly et AgaD et semblent contrôler le passage de l'eau du canal vers le site actif. La mutagenèse de ces résidus a été entreprise afin de tenter d'augmenter l'activité de transglycosylation chez ces deux enzymes. Une réduction de l'hydrolyse d'un facteur 7 et 50 au profit de l'activité de transglycosylation a été caractérisée chez les deux meilleurs mutants de Ttβgly et AgaD, respectivement. L'analyse des simulations a révélé que ces résultats étaient corrélés à une augmentation de la dynamique des molécules d'eau internes aux deux canaux étudiés. Cette étude souligne ainsi l'importance fonctionnelle de l'eau interne aux hydrolases et suggère que l'ingénierie de sa dynamique peut constituer une approche originale pour convertir les GH en transglycosidases.
jeudi octobre 27
Johann DION
Omniprésentes dans le règne animal et végétal, les galectines occupent de nombreuses fonctions biologiques au sein des organismes vivants. Cette famille de lectines, capable de se lier aux B-galactosides grâce à un domaine de reconnaissance des sucres conservé, compte quinze membres chez les mammifères. Ces protéines ont pu être identifiées comme des acteurs importants de plusieurs processus biologiques tels que le cycle cellulaire, la réponse immunitaire ou encore la migration cellulaire. Plus récemment les galectines ont été identifiés comme des cibles thérapeutiques de choix car la dérégulation de l'expression de ces protéines a pu être corrélée à plus d'une centaine de pathologies (cancer, diabète, maladie inflammatoire,…). L’un des enjeux majeurs concernant la recherche sur ces protéines, est de parvenir à synthétiser des outils permettant une meilleure compréhension de leurs rôles au sein de l’organisme. Portant une attention plus particulière à la galectine-3, nous avons mis au point des voies de synthèses permettant l’obtention d’inhibiteurs affins et sélectifs de cette dernière, et ce dans le but d'être utilisés comme outils dans l'étude du rôle des galectines dans le phénomène de migration cellulaire des cellules épithéliales de la peau. Appliquant une réaction d’azido-phenylsélénation au lactal ou par une approche chimio-enzymatique, nous avons pu synthétiser deux familles de nouveaux composés dérivés de la lactosamine. L’affinité et la sélectivité de ces composés vis-à-vis des galectines ont été déterminées par des techniques de bio-puces, de polarisation de fluorescence ou encore de microcalorimétrie.
mercredi juin 22
Denis VELIC
Les cellules humaines sont soumises à des stress induisant des cassures double-brin de l’ADN (CDB). Ces CDB sont réparées notamment par la recombinaison homologue, impliquant les protéines RAD51 et RAD52. Une stratégie thérapeutique émergente est de développer des molécules inhibant RAD51 ou RAD52 afin d’accentuer l’instabilité génétique et la mort de la cellule cancéreuse. En effet, dans certains cancers, l’activité de RAD51 est dérégulée promouvant la prolifération tumorale. Il existe plusieurs molécules inhibitrices de RAD51 et nous nous sommes intéressés au DIDS dont le mode d’action n’a pas encore été déterminé. Concernant RAD52, une létalité synthétique a été montrée lorsque celle-ci est inactivée dans des cellules déficientes en BRCA1, BRCA2 ou PALB2, trois gènes mutés dans de nombreux cancers. Récemment, trois types de molécules inhibitrices de RAD52 ont été mis en évidence. Nous avons tout d’abord étudié l’impact du DIDS ainsi que des molécules dérivées afin de comprendre le mécanisme mis en jeu. Nous avons montré que le DIDS, ainsi que ses dérivés inhibent la liaison de RAD51 à l’ADN. Ces molécules empêchent la formation du nucléofilament entrainant une diminution du nombre de foyers RAD51. Nous avons développé une méthode de criblage par fluorescence pour évaluer l’effet d’une banque de 696 molécules sur la capacité de RAD52 à hybrider deux ADNsb. Deux molécules capables d’inhiber la fonction d’hybridation de RAD52 ont été mises au jour. In vivo, elles entrainent une diminution de la survie de cellules déficientes en PALB2. La recherche et le développement de nouveaux inhibiteurs de RAD51 et RAD52 constituent des stratégies thérapeutiques d’avenir.
vendredi décembre 04
Marine GOUX
La tomographie par émission de positon (TEP) est une technique d’imagerie médicale permettant le diagnostic et le suivi de patient en oncologie. L’utilisation des anticorps et de leurs fragments pour le ciblage de biomarqueurs en TEP présente de nombreuses difficultés liées notamment à leur clairance lente (taille >100 kDa). Leur marquage, faisant intervenir principalement des réactions peu spécifiques, conduit à un mélange hétérogène de produits et parfois à l’inactivation des protéines. Le développement d’un nouvel outil de suivi in vivo des patients à l’aide de petites protéines alternatives aux anticorps, les Nanofitines (NF), permet de s’affranchir des contraintes liées à la taille (NF ≈ 10 kDa). La mise en place d’une stratégie de marquage originale et site- spécifique d’une NF sans étape de couplage chimique a d’abord été envisagée dans cette étude. L’approche est basée sur la capacité naturelle des phosphates à fixer des cations métalliques. L’insertion génétique d’une étiquette peptidique phosphorylable, in vivo ou in vitro, a permis la chélation d’un lanthanide en solution, le Tb(III), avec une affinité de l’ordre du μM. La seconde génération d’étiquettes peptidiques obtenues par mutagenèse a permis la chélation du Tb(III) avec une affinité d’environ 500 nM à pH7 et 50 nM à pH5,5, et une affinité pour le Ga(III) de l’ordre du μM à pH5,5. Parallèlement, la biodistribution et le ciblage spécifique in vivo d’une NF anti-EGFR radiomarquée à l’aide du 18F-FBEM ont été évalués dans un double modèle tumoral murin. Les images TEP obtenues avec un bon contraste ont permis de valider la preuve de concept quant à l’utilisation des NF en tant qu’outil en imagerie médicale.
jeudi novembre 26
Brendan ALLIGAND
La Recombinaison Homologue (RH) permet la réparation des dommages à l’ADN les plus délétères : les Cassures double brin. L’étape centrale de la RH est basée sur l’activité d’échange de brins de RAD51. Ainsi, l’activité de RAD51 est cruciale pour le maintien de l’intégrité génomique. Toutefois, cette protéine possède également un côté sombre. En effet, la surexpression de RAD51 permet aux cellules cancéreuses de résister aux traitements. Ce qui en fait une cible thérapeutique potentielle pour sensibiliser les cellules cancéreuses au traitement. Une meilleure compréhension du contrôle de l’activité de RAD51 aiderait sûrement à développer des stratégies thérapeutiques. L’activité de RAD51 est régulée par des phosphorylations et plusieurs kinases sont connues pour cibler RAD51. C’est le cas de la kinase c-Abl qui phosphoryle les tyrosines Y54 et Y315 en réponse aux dommages à l’ADN. Mais le rôle de ces phosphorylations est peu connu. C’est pourquoi nous nous sommes intéressés à l’effet de ces phosphorylations sur RAD51. Dans ce but, nous avons produit des mutants de RAD51 mimant la phosphorylation. Leur activité a été analysée et comparée in vitro. Nous avons démontré que le mutant équivalent à une double phosphorylation est incapable de réaliser l’échange de brins. Un défaut de polymérisation de RAD51 serait à l’origine de cette inhibition. Par la suite, la régulation a été étudiée dans le contexte cellulaire. Les résultats préliminaires montrent un effet de la double phosphorylation sur la localisation cellulaire de RAD51. L’inactivation de RAD51 par cette double phosphorylation pourrait participer à la régulation de la voie de la Recombinaison Homologue et serait une étape clef dans la compréhension de la réponse aux dommages à l’ADN
mercredi septembre 30
Nicolas FONTAINE
L’hydrogène est un candidat viable pour la prochaine génération de carburant grâce à sa den- sité d’énergie élevée et à son caractère non polluant lors de la phase de production d’énergie. La production biologique à partir de microorganismes capable de synthétiser l’hydrogène, souffre actuellement de faibles rendements de production car les cellules doivent maintenir différentes activités cellulaires, autres que la production d’hydrogène, afin de survivre. Pour répondre à ce problème, des chercheurs ont exploré l’assemblage synthétique d’enzymes in vitro dans des systèmes acellulaires ayant des fonctions spécifiques. Un tel système synthétique acellulaire a été conçu en combinant 13 différentes enzymes pour la synthèse de l’hydrogène à partir de différents composés cellulosiques dont le cellobiose. Cet assemblage a un meilleur rendement que les systèmes basés sur l’exploitation de microorganismes. Nous avons utilisé des méthodes basées sur la résolution d’équations différentielles pour étudier comment les conditions initiales et les paramètres cinétiques des enzymes influençaient la productivité d’un tel système, et pour identifier, à travers des simulations, les conditions optimisant la production d’hydrogène à partir de cellobiose comme substrat. En outre, si les paramètres cinétiques des enzymes constitutives d’un tel système ne sont pas connus, nous avons montré comment, en utilisant des réseaux de neurones artificiels, il est possible d’identifier d’autres modèles qui permettent d’avoir une idée de la cinétique de la production d’hydrogène. Au cours de notre étude sur le système utilisant le cellobiose, d’autres assemblages acellulaires ont été conçus pour produire de l’hydrogène à partir de différentes matières premières. Intéressé dans la reconstruction de systèmes synthétiques, nous avons décidé de concevoir divers outils pour aider à l’automatisation de l’assemblage et de la modélisation de ces nouveaux réseaux synthétiques. Ce travail démontre comment la modélisation peut aider dans la conception et la caractérisation des systèmes acellulaires en biologie synthétique.
mercredi septembre 30

Simon HUET
La reconnaissance moléculaire, ou formation spécifique de complexes entre molécules par l'intermédiaire d’interactions physico-chimiques, est un mécanisme d’action fondamental des protéines appliquées à un usage médical. Dans cette étude, nous explorons l'ingénierie rationnelle de cette fonction avec comme partenaire une nouvelle classe de protéines destinée à développer les médicaments de demain: les Nanofitines (NF). Dans l’objectif de guider les approches expérimentales (in vitro) par celles prédictives (in silico) dans une collaboration réciproque, ce manuscrit décrit successivement deux preuves de concept appliquées à des NF dirigées contre la protéine de fluorescence verte (GFP). La première approche, conçue pour l’humanisation de NF par transfert sur des protéines humaines, a consisté à isoler 11 résidus fonctionnels à greffer à partir de NF anti-GFP générées par ribosome display. Le squelette du feuillet beta exposant ces acides aminés clés a ensuite été recherché dans une banque structurale pour identifier trois protéines humaines hôtes arborant un feuillet similaire (RMS ≤ 0,63Å). Une fois greffées des résidus clés des NF, ces protéines ont démontré une insolubilité ou une absence de fixation détectable à la GFP, contrairement à un homologue structural des NF. La seconde approche a visé à réaliser le design de novo de NF anti-GFP par modélisation moléculaire. Cette démarche, proposée comme alternative rationnelle complémentaire du procédé de sélection in vitro, a abouti à la découverte d’une NF dont l’épitope ciblé s’avère compatible avec les prédictions réalisées. Cette stratégie nécessitera d’être complétée afin d’optimiser l’affinité des NF générées de novo.
dimanche septembre 27
Nicolas FONTAINE
L'épuisement annoncé dans les prochaines décennies des ressources fossiles qui fournissent actuellement plus de 70% du carburant consommé dans les transports terrestres, aériens et maritimes au niveau mondial, incite à l'identification et le développement de nouvelles sources d'énergies renouvelables. La production de biocarburants issue de l'exploitation de la biomasse représente une des voies de recherche les plus prometteuses. Si la première génération des biocarburants (production à partir de plantes sucrières, de céréales ou d'oléagineux) atteint ses limites (concurrence avec les usages alimentaires, en particulier), la deuxième génération, produite à partir de ressources carbonées non alimentaires (lignocellulosique, mélasse, vinasse...), pourrait prendre le relais, une fois que les procédés de conversion seront suffisamment maîtrisés. À plus long terme, une troisième génération pourrait voir le jour, qui reposerait sur l'exploitation de la biomasse marine (microalgues, en particulier) mais où de nombreux verrous restent toutefois à lever : optimisation des procédés de culture et de récolte, extraction à coût réduit, optimisation des voies métaboliques etc. Il est à retenir que la stratégie nationale de recherche et d'innovation (SNRI) a retenu quatre « domaines clés » pour l'énergie : le nucléaire, le solaire photovoltaïque, les biocarburants de deuxième génération et les énergies marines. Ceux-ci sont complétés, au nom de leur contribution potentielle à la lutte contre le changement climatique, par le stockage du CO2, la conversion de l'énergie (dont les piles à combustible) et l'hydrogène. Le présent projet de recherche s'intéresse à explorer des voies d'amélioration de l'efficacité de la biotransformation de matière organique non alimentaire de nature industrielle en biocarburants de deuxième génération. En particulier, on s'intéressera à deux aspects complémentaires : l'optimisation des organismes microbiens et des voies métaboliques pour l'amélioration du rendement biologique de fabrication de biocarburants ; l'optimisation des procédés de mise en culture des microorganismes et d'extraction des biocarburant. Le projet de thèse consiste à mettre en œuvre les biotechnologies blanches, la biologie de synthèse et le génie des procédés pour la caractérisation de souches bactériennes, de leurs voies métaboliques et de prototypes expérimentaux pour la fabrication de biocarburants, de méthane et d'hydrogène à partir de rejets provenant de l'industrie sucrière de La Réunion, à savoir la mélasse ou la vinasse. Ce projet permettrait d'envisager de nouvelles perspectives de valorisation pour ces déchets industriels et de participer à la construction, à terme, d'une industrie réunionnaise durable des biocarburants et de l'hydrogène.